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一、 實(shí)驗(yàn)原理

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) ( PCR) 可對特定核苷酸片斷進(jìn)行指數(shù)級的擴(kuò)增。在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束之后，我們可以通過凝膠電泳的方法對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定性的分析，也可以通過放射性核素?fù)饺霕?biāo)記后的光密度掃描來進(jìn)行定量的分析。無論定性還是定量分析，分析的都是 PCR 終產(chǎn)物。但是在許多情況下，我們所感興趣的是未經(jīng) PCR 信號放大之前的起始模板量。例如我們想知道某一轉(zhuǎn)基因動植物轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)或者某一特定基因在特定組織中的表達(dá)量。在這種需求下熒光定量 PCR 技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。所謂的實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 就是通過對 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實(shí)時(shí)檢測從而實(shí)現(xiàn)對起始模板定量及定性的分析。在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 反應(yīng)中，引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著 PCR 反應(yīng)的進(jìn)行， PCR 反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強(qiáng)度信號，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖  。

 

一般而言，熒光擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段 , 熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，我們無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加。 PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR 產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和 CT 值。熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個值，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，但一般我們將熒光域值的缺省設(shè)置是 3-15 個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10 倍。每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為 CT 值（ threshold value ）。

 

CT 值與起始模板的關(guān)系研究表明，每個模板的 CT 值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多， CT 值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)代表 Ct 值（如圖 3 所示）。因此，只要獲得未知樣品的 Ct 值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。

熒光探針和熒光染料

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 的化學(xué)原理包括探針類和非探針類兩種，探針類是利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，非探針類則是利用熒光染料或者特殊設(shè)計(jì)的引物來指示擴(kuò)增的增加。前者由于增加了探針的識別步驟，特異性更高，但后者則簡便易行。

1．SYBR Green I

SYBR Green I 是一種結(jié)合于小溝中的雙鏈 DNA 結(jié)合染料。與雙鏈 DNA 結(jié)合后，其熒光大大增強(qiáng)。這一性質(zhì)使其用于擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測非常理想。 SYBR Green I 的最大吸收波長約為 497nm ，發(fā)射波長最大約為 520nm 。在 PCR 反應(yīng)體系中，加入過量 SYBR 熒光染料， SYBR 熒光染料特異性地?fù)饺?DNA 雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的 SYBR 染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與 PCR 產(chǎn)物的增加完全同步。

優(yōu)勢：SYBR Green I 在核酸的實(shí)時(shí)檢測方面有很多優(yōu)點(diǎn)，由于它與所有的雙鏈 DNA 相結(jié)合，不必因?yàn)槟０宀煌貏e定制，因此設(shè)計(jì)的程序通用性好，且價(jià)格相對較低。利用熒光染料可以指示雙鏈 DNA 熔點(diǎn)的性質(zhì)，通過熔點(diǎn)曲線分析可以識別擴(kuò)增產(chǎn)物和引物二聚體，因而可以、區(qū)分非特異擴(kuò)增，進(jìn)一步地還可以實(shí)現(xiàn)單色多重測定。此外，由于一個 PCR 產(chǎn)物可以與多分子的染料結(jié)合，因此 SYBR Green I 的靈敏度很高。但是，由于 SYBR Green I 與所有的雙鏈 DNA 相結(jié)合，因此由引物二聚體、單鏈二級結(jié)構(gòu)以及錯誤的擴(kuò)增產(chǎn)物引起的假陽性會影響定量的精確性。通過測量升高溫度后熒光的變化可以幫助降低非特異產(chǎn)物的影響。由解鏈曲線來分析產(chǎn)物的均一性有助于分析由 SYBR Green I 得到定量結(jié)果。

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2．分子信標(biāo)（molecular beacon）

分子信標(biāo)是一種在靶 DNA 不存在時(shí)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的雙標(biāo)記寡核苷酸探針。在此發(fā)夾結(jié)構(gòu)中，位于分子一端的熒光基團(tuán)與分子另一端的淬滅基團(tuán)緊緊靠近。在此結(jié)構(gòu)中，熒光基團(tuán)被激發(fā)后不是產(chǎn)生光子，而是將能量傳遞給淬滅劑，這一過程稱為熒光諧振能量傳遞（ FRET ）。由于 " 黑色 " 淬滅劑的存在，由熒光基團(tuán)產(chǎn)生的能量以紅外而不是可見光形式釋放出來。如果第二個熒光基團(tuán)是淬滅劑，其釋放能量的波長與熒光基團(tuán)的性質(zhì)有關(guān)。分子信標(biāo)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，環(huán)一般為 15-30 個核苷酸長，并與目標(biāo)序列互補(bǔ)；莖一般 5-7 個核苷酸長，并相互配對形成莖的結(jié)構(gòu)。熒光基團(tuán)連接在莖臂的一端，而淬滅劑則連接于另一端。分子信標(biāo)必須非常仔細(xì)的設(shè)計(jì)，以致于在復(fù)性溫度下，模板不存在時(shí)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，模板存在時(shí)則與模板配對。與模板配對后，分子信標(biāo)的構(gòu)象改變使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分開。當(dāng)熒光基團(tuán)被激發(fā)時(shí)，它發(fā)出自身波長的光子。

3．TaqMan 探針

 

圖 6 Taqman 探針工作原理

TaqMan 探針是多人擁有的專利技術(shù)。 TaqMan 探針是一種寡核苷酸探針，它的熒光與目的序列的擴(kuò)增相關(guān)。它設(shè)計(jì)為與目標(biāo)序列上游引物和下游引物之間的序列配對。熒光基團(tuán)連接在探針的 5’ 末端，而淬滅劑則在 3’ 末端。當(dāng)完整的探針與目標(biāo)序列配對時(shí)，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與 3’ 端的淬滅劑接近而被淬滅。但在進(jìn)行延伸反應(yīng)時(shí)，聚合酶的 5’ 外切酶活性將探針進(jìn)行酶切，使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分離。 TaqMan 探針適合于各種耐熱的聚合酶，如 DyNAzymeTM II DNA 聚合酶（ MJ Research 公司有售）。隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加，釋放出來的熒光基團(tuán)不斷積累。因此熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量呈正比關(guān)系。

4. LUX Primers

 

圖 7 LUX 引物工作原理

LUX (light upon extention) 引物是利用熒光標(biāo)記的引物實(shí)現(xiàn)定量的一項(xiàng)新技術(shù)。目標(biāo)特異的引物對中的一個引物 3’ 端用熒光報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記。在沒有單鏈模板的情況下，該引物自身配對，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使熒光淬滅。在有目標(biāo)片斷的時(shí)候，引物與模板配對，發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開，產(chǎn)生特異的熒光信號（如圖 7 ）。

與 Taqman 探針和分子信標(biāo)相比， LUX 引物通過二級結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)淬滅，不需要熒光淬滅基團(tuán)，也不需要設(shè)計(jì)特異的探針序列。因?yàn)?LUX 引物是一個相對較新的技術(shù)，所以其應(yīng)用還有待實(shí)踐的檢驗(yàn)。

二、實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)的應(yīng)用

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)是核酸定量技術(shù)的一次飛躍。運(yùn)用該項(xiàng)技術(shù)，我們可以對 DNA 、 RNA 樣品進(jìn)行定量和定性分析。定量分析包括絕對定量分析和相對定量分析。前者可以得到某個樣本中基因的拷貝數(shù)和濃度；后者可以對不同方式處理的兩個樣本中的基因表達(dá)水平進(jìn)行比較。除此之外我們還可以對 PCR 產(chǎn)物或樣品進(jìn)行定性分析：例如利用熔解曲線分析識別擴(kuò)增產(chǎn)物和引物二聚體，以區(qū)分非特異擴(kuò)增；利用特異性探針進(jìn)行基因型分析及 SNP 檢測等。目前實(shí)時(shí)熒光 PCR 技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科學(xué)研究、臨床診斷、疾病研究及藥物研發(fā)等領(lǐng)域。其中最主要的應(yīng)用集中在以下幾個方面：

1. DNA 或 RNA 的絕對定量分析。包括病原微生物或病毒含量的檢測, 轉(zhuǎn)基因動植物轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的檢測，RNAi 基因失活率的檢測等。

2. 基因表達(dá)差異分析。例如比較經(jīng)過不同處理樣本之間特定基因的表達(dá)差異 ( 如藥物處理、物理處理、化學(xué)處理等 )，特定基因在不同時(shí)相的表達(dá)差異以及cDNA 芯片或差顯結(jié)果的確證

3. 基因分型。例如 SNP 檢測，甲基化檢測等。

隨著實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)的推廣和普及，該技術(shù)必然會得到更廣泛的應(yīng)用。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1 樣品RNA的抽提

在收集到生物材料之后，最好能即刻進(jìn)行RNA制備工作。若需暫時(shí)儲存，則應(yīng)以液氮將生物材料急速冷凍后，儲存于-80℃冷凍柜。在制備RNA時(shí)，將儲存于冷凍柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式破碎細(xì)胞，不可以先行解凍，以避免RNase的作用。

1. 提取組織RNA時(shí)，每50～100mg組織用1ml Trizol試劑對組織進(jìn)行裂解；提取細(xì)胞RNA時(shí)，先離心沉淀細(xì)胞，每5-10 ╳106個細(xì)胞加1ml Trizol后，反復(fù)用槍吹打或劇烈振蕩以裂解細(xì)胞；貼壁細(xì)胞可直接棄培養(yǎng)基后加Trizol裂解。

2. 將上述組織或細(xì)胞的Trizol裂解液轉(zhuǎn)入EP管中,在室溫15~30C下放置5分鐘；

3. 在上述EP管中，按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，蓋上EP管蓋子，在手中用力震蕩15秒，在室溫下（15℃～30℃）放置2～3分鐘后，12000g（2℃～8℃）離心15分鐘；

4. 取上層水相置于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.5ml的量加入異丙醇，在室溫下（15℃～30℃）放置10分鐘,12000g（2℃～8℃）離心10分鐘；

5. 棄上清，按照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇進(jìn)行洗滌，渦旋混合，7500g（2℃～8℃）離心5分鐘，棄上清；

6. 讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥；（RNA沉淀在70%乙醇中可長期保存）。

7. 用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。

2 RNA質(zhì)量檢測

1）紫外吸收法測定

先用稀釋用的TE溶液將分光光度計(jì)調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）后，讀取其在分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液濃度和純度。

① 濃度測定

A260下讀值為1表示40 μg RNA/ml。樣品RNA濃度(?g/ml)計(jì)算公式為：A260 ×稀釋倍數(shù)× 40 μg/ml。具體計(jì)算如下：

RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀釋至495μl的TE中，測得A260 = 0.21

RNA 濃度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840μg/ml 或 0.84 μg/μl

取5ul用來測量以后，剩余樣品RNA為35 μl，剩余RNA總量為：

35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg

②純度檢測

RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值范圍1.8到2.1。

3 瓊脂糖凝膠電泳測定

1. 用蒸餾水將制膠模具和梳子沖洗干凈，放在制膠平板上，封閉模具邊緣，架好梳子；

2. 根據(jù)欲分離DNA片段大小用凝膠緩沖液配制適宜濃度的瓊脂糖凝膠：準(zhǔn)確稱量瓊脂糖干粉，加入到配膠用的三角燒瓶內(nèi)，定量加入電泳緩沖液（一般20~30 ml）；

3. 放入到微波爐內(nèi)加熱熔化。冷卻片刻，加入一滴熒光染料，輕輕旋轉(zhuǎn)以充分混勻凝膠溶液，倒入電泳槽中，待其凝固；

4. 室溫下30～45分鐘后，凝膠完全凝結(jié)，小心拔出梳子，將凝膠安放在電泳槽內(nèi)；

5. 向電泳槽中倒入電泳緩沖液，其量以沒過膠面1mm為宜，如樣品孔內(nèi)有氣泡，應(yīng)設(shè)法除去；

6. 在DNA樣品中加入10×體積的載樣緩沖液（loading buffer），混勻后，用槍將樣品混合液緩慢加入被浸沒的凝膠加樣孔內(nèi)；

7. 接通電源，紅色為正極，黑色為負(fù)極，切記DNA樣品由負(fù)極往正極泳動 (靠近加樣孔的一端為負(fù))。一般60～100V電壓，電泳20～40min即可；

8. 根據(jù)指示劑泳動的位置，判斷是否終止電泳；

9. 電泳完畢，關(guān)上電源，在凝膠成像儀上觀察電泳帶及其位置，并與核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker比較被擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。

4 紫外透射光下觀察并拍照

28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃（其大小決定于用于抽提RNA的物種類型），上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個更小稍微擴(kuò)散的帶，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖體RNA）組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質(zhì)，可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備過程中如果出現(xiàn)DNA污染，將會在28S核糖體RNA帶的上面出現(xiàn)，即更高分子量的彌散遷移物質(zhì)或者帶，RNA的降解表現(xiàn)為核糖體RNA帶的彌散。用數(shù)碼照相機(jī)拍下電泳結(jié)果。

5樣品cDNA合成

①反應(yīng)體系

序號 反應(yīng)物 劑量

1 逆轉(zhuǎn)錄buffer 2μl

2 上游引物 0.2μl

3 下游引物 0.2μl

4 dNTP 0.1μl

5 逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV 0.5μl

6 DEPC水 5μl

7 RNA模版 2μl

8 總體積 10μl

輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

②混合液在加入逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV 之前先70℃干浴3分鐘，取出后立即冰水浴至管內(nèi)外溫度一致，然后加逆轉(zhuǎn)錄酶0.5μl，37℃水浴60分鐘。

③取出后立即95℃干浴3分鐘，得到逆轉(zhuǎn)錄終溶液即為cDNA溶液，保存于-80℃待用。

6梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品及待測樣品的內(nèi)參基因（β-actin）實(shí)時(shí)定量PCR

①β-actin陽性模板的標(biāo)準(zhǔn)梯度制備陽性模板的濃度為1011，反應(yīng)前取3μl按10倍稀釋（加水27μl并充分混勻）為1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104，以備用。

②反應(yīng)體系如下：

標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)體系

序號 反應(yīng)物 劑量

1 SYBR Green 1 染料 10μl

2 陽性模板上游引物F 0.5μl

3 陽性模板下游引物R 0.5μl

4 dNTP 0.5μl

5 Taq酶 1μl

6 陽性模板DNA 5μl

7 ddH2O 32.5μl

8 總體積 50μl

輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

管家基因反應(yīng)體系：

序號 反應(yīng)物 劑量

1 SYBR Green 1 染料 10μl

2 內(nèi)參照上游引物F 0.5μl

3 內(nèi)參照下游引物R 0.5μl

4 dNTP 0.5μl

5 Taq酶 1μl

6 待測樣品cDNA 5μl

7 ddH2O 32.5μl

8 總體積 50μl

輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

③制備好的陽性標(biāo)準(zhǔn)品和檢測樣本同時(shí)上機(jī)，反應(yīng)條件為：93℃ 2分鐘，然后93℃ 1分鐘，55℃ 2分鐘，共40個循環(huán)。（可以做預(yù)實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案。）

7制備用于繪制梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線的DNA模板

①針對每一需要測量的基因，選擇一確定表達(dá)該基因的cDNA模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。

反應(yīng)體系：

序號 反應(yīng)物 劑量

1 10× PCR緩沖液 2.5 ul

2 MgCl2 溶液 1.5 ul

3 上游引物F 0.5 ul

4 下游引物R 0.5 ul

5 dNTP混合液 3 ul

6 Taq聚合酶 1 ul

7 cDNA 1 ul

8 加水至總體積為 25ul

輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

35個PCR循環(huán)（94℃1分鐘；55℃1分鐘；72℃1分鐘）； 72?C延伸5分鐘。

②PCR產(chǎn)物與 DNA Ladder在2％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶。

③將PCR產(chǎn)物進(jìn)行10倍梯度稀釋: 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行10倍梯度稀釋: 設(shè)定PCR產(chǎn)物濃度為1×1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104幾個濃度梯度。

8待測樣品的待測基因?qū)崟r(shí)定量PCR

①所有cDNA樣品分別配置實(shí)時(shí)定量 PCR反應(yīng)體系。

體系配置如下：

序號 反應(yīng)物 劑量

1 SYBR Green 1 染料 10 ul

2 上游引物 1ul

3 下游引物 1ul

4 dNTP 1ul

5 Taq聚合酶 2ul

6 待測樣品cDNA 5ul

7 ddH2O 30ul

8 總體積 50 ul

輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

②將配制好的PCR反應(yīng)溶液置于Realtime PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件為：93℃2分鐘預(yù)變性，然后按93℃ 1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘，共40做個循環(huán)，最后72℃7分鐘延伸。

9實(shí)時(shí)定量PCR使用引物列表

引物設(shè)計(jì)軟件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原則：引物與模板的序列緊密互補(bǔ)；引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)；引物不在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)(即錯配)。

10電泳

各樣品的目的基因和管家基因分別進(jìn)行Realtime PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物與 DNA Ladder在2％瓊脂糖凝膠電泳，GoldView染色，檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶。